羽衣甘蓝类受体激酶FERONIA基因克隆、表达及与相互作用蛋白分析 植物研究    2024, 44 (2): 298-306.   DOI: 10.7525/j.issn.1673-5102.2024.02.015

表1 引物信息

正文中引用本图/表的段落

根据NCBI数据库提供的甘蓝基因组序列，设计BoFER基因的CDS序列特异性引物BoFER-CDS-F和BoFER-CDS-R，用于BoFER基因CDS区的克隆。在BoFER激酶结构域（KD）序列两端设计特异性引物BoFER-KD-F和BoFER-KD-R，用于BoFER激酶域的克隆，引物均由华大基因合成（见表1）。通过E.Z.N.A.? Plant RNA Kit（OMEGA）试剂盒提取S_13-bS_13-b 柱头总RNA，利用TranScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（TransGen）试剂盒获得柱头cDNA。参考李阳等［38］的方法进行载体构建，利用LA Taq DNA聚合酶（TaKaRa）克隆基因，使用E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit（OMEGA）试剂盒回收PCR扩增产物，并将回收产物连接到pMD19-T载体连接，热激法转化到大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α中，涂于相应抗性平板上，挑取单克隆，进行菌液PCR，符合目的片段大小的菌液送至华大基因进行测序，利用TIANprep Mini Plasmid Kit（TIANGEN）试剂盒提取测序结果正确的菌液质粒。

利用E.Z.N.A.? Plant RNA Kit（OMEGA）试剂盒提取亲和及不亲和授粉后不同时间雌蕊，以及S_13-bS_13-b 株系雄蕊、花萼、花瓣、柱头、花柱及子房总RNA，使用TranScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（TransGen）合成cDNA。参照李晗等［40］的方法进行qRT-PCR，使用TransStart? Top Green qPCR SuperMix（TRANS）试剂盒配制20 μL反应体系如下：TransStart Top Green qPCR SuperMix（2X） 10 μL，cDNA 1 μL，BoFER基因上游特异性引物0.4 μL，下游特异性引物0.4 μL（引物序列见表1），ddH₂O 8.2 μL，通过LightCyker480Ⅱ （Roche）仪器进行目的基因qRT-PCR分析，程序设置：94 ℃预变性 30 s，94 ℃变性5 s，58 ℃退火30 s，40个循环，每个循环结束后采集荧光信号，所有循环结束后绘制熔解曲线。每个样品进行3次技术重复。BoACTIN基因作为内参基因［41］，通过比值分析方法计算目的基因相对表达量。

将BoFER-KD的序列构建到pGADT7（激活域，AD）表达载体上（见表1）。将BoSRK_13-b-KD、Bo-MLPK及Bo-ARC1的ORF序列构建到pGBKT7（DNA结合域，BD）表达载体上，根据酵母转化手册将重组的AD和BD质粒共转化到酵母菌株Y2HGold中，共转化质粒组合（见表2）。将酵母转化子涂布到SD/-Leu-Trp缺陷型平板上进行培养2~3 d。挑取单个酵母菌落加入到含5 mL SD/-Leu-Trp缺陷型液体培养基中，220 r·min-1培养1 d后，取5 μL培养液滴加在SD/-Leu-Trp和SD/-Leu-Trp-His+x-α-gal缺陷型平板上进行培养。利用含有3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）的SD/-Leu-Trp-His缺陷型平板对自激活试验进行验证。

本文的其它图/表

• 表2 BoFER 酵母共转化质粒组合
  
• 图1 羽衣甘蓝BoFER的RT-PCR扩增结果
  
• 图2 BoFER核苷酸及氨基酸序列
  
• 图3 BoFER蛋白结构域分析
  Ⅰ.信号肽区域；Ⅱ.Malectin-like区域；Ⅲ.跨膜螺旋区；Ⅳ.丝/苏氨酸受体激酶域；Ⅴ.低成分复杂区；碱基数标注在对应位置。
  
• 图4 BoFER氨基酸序列比对
  BoFER.羽衣甘蓝；BnFER.油菜；BrFER.白菜；CaFER.亚麻芥；AtFER.拟南芥；RsFER.萝卜；其中绿框圈出来的部分为丝氨酸、苏氨酸受体激酶结构域。
  
• 图5 BoFER在花器官中表达分析
  ***.P<0.001.
  
• 图 6 BoFER授粉后不同时间表达分析
  A.自花授粉后不同时间BoFER表达分析；B.异花授粉后不同时间BoFER表达分析（*P<0.05，**P<0.01，ns表示无显著性差异）。
  
• 图7 BoFER与BoSRK相互作用分析