基于CRISPR/Cas9敲除阐明AtMST1通过H2S合成调控拟南芥耐盐性

doi:10.7525/j.issn.1673-5102.2026.02.006

摘要/Abstract

摘要：

硫化氢（hydrogen sulfide，H₂S）是植物体内重要的气体信号分子，其生物合成依赖多种内源生成酶。3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，MST）在动物系统中已被证实能够生成H₂S，而拟南芥（Arabidopsis thaliana）MST1也被报道具有类似的酶活性。为在植物体内进一步验证AtMST1蛋白的H₂S生成功能，并探究其在盐胁迫响应中的作用，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥AtMST1基因进行定向编辑。通过设计4个靶位点并构建基因编辑载体，经农杆菌（Agrobacterium）转化后，成功获得atmst1纯合突变体。基因型分析表明，突变体在靶位点插入单个T碱基，导致移码突变及蛋白质翻译提前终止。生理检测结果显示，与野生型相比，atmst1突变体的H₂S荧光探针信号强度、H₂S含量及产率均显著降低。在盐胁迫处理下，atmst1植株表现出明显的盐敏感表型，且幼苗根中积累更多的活性氧。综上，本研究成功构建了AtMST1蛋白功能缺失突变体，从遗传学层面证实AtMST1蛋白在植物内源H₂S合成中的关键作用，并揭示其通过调节H₂S水平正调控拟南芥耐盐性的生理功能。

关键词: AtMST1基因, CRISPR/Cas9基因编辑技术, 硫化氢, 拟南芥, 盐胁迫

Abstract:

Hydrogen sulfide（H₂S） is an important gaseous signaling molecule in plants， and its biosynthesis relies on various endogenous enzymes. The enzyme 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase（MST） has been established as an H₂S generator in animal systems， and a similar enzymatic activity has been reported for Arabidopsis MST1. To further validate the H₂S-producing function of AtMST1 in plants and explore its role in salt stress response， CRISPR/Cas9-mediated gene editing to target the AtMST1 gene was employed in Arabidopsis thaliana. By designing four target sites and constructing the gene editing vector， homozygous atmst1 mutants following Agrobacterium-mediated transformation were successfully obtained. Genotyping analysis revealed that the mutant carried a single T-nucleotide insertion at the target site， resulting in a frameshift mutation and premature termination of translation. Compared with the wild type， the atmst1 mutant showed a significant reduction in the intensity of H₂S-specific fluorescent signals， as well as in both H₂S content and production rate. Salt stress treatment resulted in a clear salt-sensitive phenotype and greater reactive oxygen species accumulation in the roots of atmst1 seedlings. In summary， this study successfully created an AtMST1 loss-of-function mutant， providing genetic evidence for its crucial role in endogenous H₂S synthesis in plants and revealing its physiological function in positively regulating salt tolerance in Arabidopsis by modulating H₂S levels.

Key words: AtMST1 gene, CRISPR/Cas9 gene-editing technology, hydrogen sulfide, Arabidopsis thaliana, salt stress

中图分类号:

Q789

曹海艳, 田楷文, 贾晓宇, 郝雪峰, 金竹萍. 基于CRISPR/Cas9敲除阐明AtMST1通过H₂S合成调控拟南芥耐盐性[J]. 植物研究, 2026, 46(2): 259-269.

Haiyan CAO, Kaiwen TIAN, Xiaoyu JIA, Xuefeng HAO, Zhuping JIN. The Role of AtMST1 in Regulating Salt Tolerance via H₂S Synthesis in Arabidopsis Revealed by CRISPR/Cas9 Knockout[J]. Bulletin of Botanical Research, 2026, 46(2): 259-269.

图/表 9

图1

表1

图2

图3

图4

图5

表2

图6

图7

参考文献 34

[1]	WANG R.Physiological implications of hydrogen sulfide：a whiff exploration that blossomed［J］.Physiological Reviews，2012，92（2）：791-896.
[2]	ZHAO Y J， LI T， JIANG Z G，et al.The miR-9-5p/CXCL11 pathway is a key target of hydrogen sulfide-mediated inhibition of neuroinflammation in hypoxic ischemic brain injury［J］.Neural Regeneration Research，2024，19（5）：1084-1091.
[3]	DONG X Z， ZHANG H， DUAN P，et al.An injectable and adaptable hydrogen sulfide delivery system for modulating neuroregenerative microenvironment［J］.Science Advances，2023，9（51）：eadi1078.
[4]	CIRINO G， SZABO C， Papapetropoulos A.Physiological roles of hydrogen sulfide in mammalian cells，tissues，and organs［J］.Physiological Reviews，2023，103（1）：31-276.
[5]	SUN H J， LU Q B， ZHU X X，et al.Pharmacology of hydrogen sulfide and its donors in cardiometabolic diseases［J］.Pharmacological Reviews，2024，76（5）：846-895.
[6]	ZHAO Y Q， HU K D， YAO G F，et al.A D-cysteine desulfhydrase，SlDCD2，participates in tomato fruit ripening by modulating ROS homoeostasis and ethylene biosynthesis［J］.Horticulture Research，2023，10（3）：uhad014.
[7]	XIANG Z X， LI W， LU Y T，et al.Hydrogen sulfide alleviates osmotic stress-induced root growth inhibition by promoting auxin homeostasis［J］.The Plant Journal，2023，114（6）：1369-1384.
[8]	ZHOU M J， ZHANG J， SHEN J，et al.Hydrogen sulfide-linked persulfidation of ABI4 controls ABA responses through the transactivation of MAPKKK18 in Arabidopsis ［J］.Molecular Plant，2021，14（6）：921-936.
[9]	LISJAK M， SRIVASTAVA N， TEKLIC T，et al.A novel hydrogen sulfide donor causes stomatal opening and reduces nitric oxide accumulation［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（12）：931-935.
[10]	CHEN J， WU F H， WANG W H，et al.Hydrogen sulphide enhances photosynthesis through promoting chloroplast biogenesis，photosynthetic enzyme expression，and thiol redox modification in Spinacia oleracea seedlings［J］.Journal of Experimental Botany，2011，62（13）：4481-4493.
[11]	HAO X F， JIN Z P， WANG Z Q，et al.Hydrogen sulfide mediates DNA methylation to enhance osmotic stress tolerance in Setaria italica L.［J］.Plant and Soil，2020，453：355-370.
[12]	AROCA A， ZHANG J， XIE Y J，et al.Hydrogen sulfide signaling in plant adaptations to adverse conditions：molecular mechanisms［J］.Journal of Experimental Botany，2021，72（16）：5893-5904.
[13]	CAO H Y， LIANG Y L， ZHANG L P，et al.AtPRMT5-mediated AtLCDmethylation improves Cd²⁺tolerance via increased H₂S production in Arabidopsis ［J］.Plant Physiology，2022，190（4）：2637-2650.
[14]	裴雁曦.植物中的气体信号分子硫化氢：无香而立，其臭如兰［J］.中国生物化学与分子生物学报，2016，32（7）：721-733.
	PEI Y X.Gasotransmitter hydrogen sulfide in plant：stinking to high heaven，but refreshing to fine life［J］.Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2016，32（7）：721-733.
[15]	JARABAK R， WESTLEY J.Steady-state kinetics of 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase from bovine kidney［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，1978，185（2）：458-465.
[16]	BORDO D， BORK P.The rhodanese/Cdc25 phosphatase superfamily：sequence-structure-function relations［J］.The EMBO Reports，2002，3（8）：741-746.
[17]	RAN M X， LI Q B， XIN Y F，et al.Rhodaneses minimize the accumulation of cellular sulfane sulfur to avoid disulfide stress during sulfide oxidation in bacteria［J］.Redox Biology，2022，53：102345.
[18]	PAPENBROCK J， SCHMIDT A.Characterization of a sulfurtransferase from Arabidopsis thaliana ［J］.European Journal of Biochemistry，2000，267（1）：145-154.
[19]	CROPPI G， ZHOU Y Y， YANG R，et al.Discovery of an inhibitor for bacterial 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase that synergistically controls bacterial survival［J］.Cell Chemical Biology，2020，27（12）：1483-1499.
[20]	BAUER M， DIETRICH C， NOWAK K，et al.Intracellular localization of Arabidopsis sulfurtransferases［J］.Plant Physiology，2004，135（2）：916-926.
[21]	BARTELS A， MOCK H P， PAPENBROCK J.Differential expression of Arabidopsis sulfurtransferases under various growth conditions［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2007，45（3/4）：178-187.
[22]	GURETZKI S， PAPENBROCK J.Characterization of the sulfurtransferase family from Oryza sativa L［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2011，49（9）：1064-1070.
[23]	HAO X F， CAO H Y， XIE M J，et al.AtMST1：a novel hydrogen sulfide-producing enzyme that enhances drought tolerance in Arabidopsis ［J］.Plant and Soil，2026，518（1）：389-402.
[24]	KABIL O， VITVITSKY V， XIE P，et al.The quantitative significance of the transsulfuration enzymes for H₂S production in murine tissues［J］.Antioxidants & Redox Signaling，2011，15（2）：363-372.
[25]	KIMURA H.Production and physiological effects of hydrogen sulfide［J］.Antioxidants & Redox Signaling，2014，20（5）：783-793.
[26]	PEDRE B， DICK T P.3-Mercaptopyruvate sulfurtransferase：an enzyme at the crossroads of sulfane sulfur trafficking［J］.Biological Chemistry，2021，402（3）：223-237.
[27]	FRÄSDORF B， RADON C， LEIMKÜHLER S.Characterization and interaction studies of two isoforms of the dual localized 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase TUM1 from humans［J］.Journal of Biological Chemistry，2014，289（50）：34543-34556.
[28]	PAPENBROCK J， RIEMENSCHNEIDER A， KAMP A，et al.Characterization of cysteine-degrading and H₂S-releasing enzymes of higher plants：from the field to the test tube and back［J］.Plant Biology，2007，9（5）：582-588.
[29]	ALVAREZ C， CALO L， ROMERO L C，et al.An O-acetylserine（thiol）lyase homolog with L-cysteine desulfhydrase activity regulates cysteine homeostasis in Arabidopsis ［J］.Plant Physiology，2010，152（2）：656-669.
[30]	WIRTZ M， DROUX M， HELL R. O-acetylserine （thiol） lyase：an enigmatic enzyme of plant cysteine biosynthesis revisited in Arabidopsis thaliana ［J］.Journal of Experimental Botany，2004，55（404）：1785-1798.
[31]	LIU Z Q， QU J J， ZHANG L P，et al.Cloning of cucumber LCD and DES gene and their response to abiotic stress［J］.Scientia Horticultura，2021，278：109802.
[32]	JIN Z P， SUN L M， YANG G D，et al.Hydrogen sulfide regulates energy production to delay leaf senescence induced by drought stress in Arabidopsis ［J］.Frontiers in Plant Science，2018，9：1722.
[33]	LIU D M， LI J， LU J J，et al.Cloning and functional analysis of four O-acetylserine （thiol） lyase family genes from foxtail millet［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2019，139：325-332.
[34]	RIEMENSCHNEIDER A， WEGELE R， SCHMIDT A，et al.Isolation and characterization of a D-cysteine desulfhydrase protein from Arabidopsis thaliana ［J］.FEBS Journal，2005，272（5）：1291-1304.

引物名称 Primer name	引物编号 Primer ID	引物序列5′→3′ Primer sequence	用途 Purpose
AtMST1-gRNA1-F1	pp2043	ATTGGAAGAGAAGGAGTAATCAGT	gRNA1靶点扩增
AtMST1-gRNA1-R1	pp2044	AAACACTGATTACTCCTTCTCTTC	gRNA1靶点扩增
AtMST1-gRNA2-F2	pp2045	ATTGGTTACTCCACATCATCCGTA	gRNA2靶点扩增
AtMST1-gRNA2-R2	pp2046	AAACTACGGATGATGTGGAGTAAC	gRNA2靶点扩增
AtMST1-gRNA3-F3	pp2047	ATTGAAATCCGATCCAAGAATATC	gRNA3靶点扩增
AtMST1-gRNA3-R3	pp2048	AAACGATATTCTTGGATCGGATTT	gRNA3靶点扩增
AtMST1-gRNA4-F4	pp2049	ATTGGCCACATATGTTGCCCACTG	gRNA4靶点扩增
AtMST1-gRNA4-R4	pp2050	AAACCAGTGGGCAACATATGTGGC	gRNA4靶点扩增
AtMST1-F	pp2247	ATGGCCTCGACCCTTTTCTC	AtMST1阳性植株编辑位点鉴定
AtMST1-R	pp2250	GACCTCCATCGAGCACCCA	AtMST1阳性植株编辑位点鉴定
CAS9-F	pp2060	GCCTGTTCGGAAACCTGAT	Cas9鉴定
CAS9-R	pp2061	GTAGCCGTTCTTGCTCTGG	Cas9鉴定
pKI1.1R-F	pp1729	TGGGAAAGAACAATAGTAT	载体引物，阳性克隆的鉴定

克隆类型 Clone type	数量 Number	占比 Percentage/%
总计	42	100
携带T插入的突变克隆	21	50
携带A插入的突变克隆	8	19
野生型序列克隆	13	31

基于CRISPR/Cas9敲除阐明AtMST1通过H₂S合成调控拟南芥耐盐性

The Role of AtMST1 in Regulating Salt Tolerance via H₂S Synthesis in Arabidopsis Revealed by CRISPR/Cas9 Knockout

RichHTML

PDF (PC)

补充材料

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表 9

参考文献 34

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张力鹏, 武美, 王宏鹏, 李天宇. 大花红景天盐胁迫调控基因RcNAC22克隆及功能分析[J]. 植物研究, 2026, 46(2): 246-258.
[2]	李政, 陈凤欣, 刘雨奇, 李明明, 尹嘉璨, 刘超, 夏新莉. 过表达PtrMYB002基因抑制拟南芥生长并提高其抗旱性[J]. 植物研究, 2026, 46(1): 67-82.
[3]	马秀英, 李金克, 周晓阳, 陈少良. Ca²⁺-ATPase参与植物耐盐性调控的研究进展[J]. 植物研究, 2024, 44(5): 641-654.
[4]	张衡锋, 何阳武, 张焕朝, 韦庆翠. 紫薇响应盐胁迫和碱胁迫的代谢组分析[J]. 植物研究, 2024, 44(3): 420-430.
[5]	郝雪峰, 贾晓宇, 曹海艳, 亢春霞, 裴雁曦. 一株拟南芥宽叶形突变体atscamp的分离鉴定[J]. 植物研究, 2024, 44(2): 232-238.
[6]	刘玮, 朱自强. 植物根部热形态建成的研究进展[J]. 植物研究, 2024, 44(1): 1-7.
[7]	方发之, 桂慧颖, 黎肇家, 张晓凤. 6种红树幼苗对不同盐度的生理适应性[J]. 植物研究, 2023, 43(6): 881-889.
[8]	江转转, 龚莉, 宋亚玲. 拟南芥叶绿体分裂蛋白PARC6影响子叶与真叶的生长[J]. 植物研究, 2023, 43(5): 700-710.
[9]	隋德宗, 王保松. 盐胁迫下乌桕无性系叶片的比较蛋白组学研究[J]. 植物研究, 2023, 43(5): 679-689.
[10]	徐磊, 胥晓, 刘沁松. 外源水杨酸对盐胁迫下珙桐幼苗抗氧化系统和基因表达的影响[J]. 植物研究, 2023, 43(4): 572-581.
[11]	郑晟, 高海霞, 苏敏, 卢尚欢, 张腾国, 武国凡. 外源蔗糖影响AtKEA1和AtKEA2调节拟南芥幼苗根的生长[J]. 植物研究, 2023, 43(4): 562-571.
[12]	蔡圆圆, 夏季奔奔, 应文涵, 王洁瑶, 谢涛, 邢孔丫, 冯宣军, 华学军. 拟南芥线粒体蛋白突变体ssr1-2表型的详细鉴定与分析[J]. 植物研究, 2023, 43(3): 421-431.
[13]	裘喻平, 王益川, 郭红卫. 植物根毛发育调控机制的研究进展[J]. 植物研究, 2023, 43(3): 321-332.
[14]	刘森尧, 贾丰璘, 国庆, 樊高锋, 周博如, 姜廷波. 小黑杨转录因子PsnbHLH162基因在盐和低温胁迫下应答分析[J]. 植物研究, 2023, 43(2): 300-310.
[15]	廖诗贤, 王宇婷, 董立本, 顾咏梅, 贾丰璘, 姜廷波, 周博如. 小黑杨转录因子PsnbZIP1应答盐胁迫功能分析[J]. 植物研究, 2023, 43(2): 288-299.