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小黑杨Rubisco小亚基基因启动子的克隆及表达活性分析
植物研究
2024, 44 (4):
625-633.
DOI: 10.7525/j.issn.1673-5102.2024.04.014
核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）是光合作用中决定碳同化速率的关键酶，其中小亚基（rbcS）是由核基因编码，并且主要在叶片中表达。利用RT-qPCR技术确定了小黑杨（Populus×xiaohei）叶片中高表达的Rubisco小亚基基因PxrbcS1和PxrbcS2基因，并克隆了其上游2 240、2 174 bp的启动子。对其进行启动子元件分析结果表明，PxrbcS1和PxrbcS2的启动子具有多个与光诱导表达相关的元件，例如G-box、MRE和Box 4等元件。构建pBI-121-pPxrbcS1：：GUS和pBI-121-pPxrbcS2：：GUS植物表达载体并遗传转化84K杨（P. alba× P. glandulosa）。GUS组织化学染色以及qPCR表达分析表明PxrbcS1和PxrbcS2的启动子能够驱动GUS基因在84K杨叶片特异性高表达。总之，上述结果表明该研究成功地从小黑杨中克隆了具有叶片高表达活性的PxrbcS1和PxrbcS2的启动子，该启动子可应用到包括杨树在内的植物光合作用相关的基因功能研究以及提高植物光合作用的遗传操作中。
表1
小黑杨 PxrbcS1 、 PxrbcS2 启动子顺式作用元件分析
正文中引用本图/表的段落
核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）是光合作用中决定碳同化速率的关键酶，其中小亚基（rbcS）是由核基因编码，并且主要在叶片中表达。利用RT-qPCR技术确定了小黑杨（Populus×xiaohei）叶片中高表达的Rubisco小亚基基因PxrbcS1和PxrbcS2基因，并克隆了其上游2 240、2 174 bp的启动子。对其进行启动子元件分析结果表明，PxrbcS1和PxrbcS2的启动子具有多个与光诱导表达相关的元件，例如G-box、MRE和Box 4等元件。构建pBI-121-pPxrbcS1：：GUS和pBI-121-pPxrbcS2：：GUS植物表达载体并遗传转化84K杨（P. alba× P. glandulosa）。GUS组织化学染色以及qPCR表达分析表明PxrbcS1和PxrbcS2的启动子能够驱动GUS基因在84K杨叶片特异性高表达。总之，上述结果表明该研究成功地从小黑杨中克隆了具有叶片高表达活性的PxrbcS1和PxrbcS2的启动子，该启动子可应用到包括杨树在内的植物光合作用相关的基因功能研究以及提高植物光合作用的遗传操作中。
启动子是RNA聚合酶识别、结合和启动转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，启动子决定着基因表达的组织特异性以及表达量［1］。启动子可分为3类：组成型启动子、组织特异型启动子、诱导型启动子［2］。在植物的基因工程育种中，组成型启动子，如花椰菜病毒CaMV35S能驱动外源基因在植物组织和器官的任意部位表达［3-4］，但基因表达的时空性不能有效控制，因此实践中存在一定缺陷。组织特异型启动子只在特定的生长阶段或组织部位高效启动基因表达。在植物的遗传转化中运用组织特异型启动子控制目标基因的表达能更有效地避免使用组成型启动子带来的潜在负作用［5］。因此研究者对组织特异型启动子的研究和应用越来越重视。
使用CTAB法分别提取野生型小黑杨叶片总RNA，反转录成cDNA；将PxUBQ7（Potri.0005G220-60）作为内参基因，利用附表1（见本刊网站）中的引物进行RT-qPCR，采用2-ΔΔCT法分析定量数据，以上试验均设置3个生物学重复。
利用DNA提取试剂盒（北京擎科生化科技有限公司）提取小黑杨的总DNA。根据已有的 PxrbcS1、PxrbcS2基因位点上游前2 240、2 174 bp序列（小黑杨Rubisco小亚基基因序列由东北林业大学国家重点实验室提供），设计5′端及3′端特异引物，引物序列见表1。扩增PxrbcS1、PxrbcS2基因启动子编码区。根据附表1中的引物进行目的片段扩增，反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 15 s，共35个循环；72 ℃再延伸7 min，PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。凝胶回收试剂盒（北京擎科生物科技股份有限公司）回收目的片段，并连入Zero TOPO-Blunt载体中，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态，对获得的单克隆进行菌落PCR验证，筛选后的阳性克隆质粒分别命名为PxrbcS1、PxrbcS2，送至哈尔滨生工生物技术有限公司测序。克隆序列见本刊网站电子附件。
通过附表1引物扩增的目的片段，利用ClaⅠ、BamHⅠ分别对PBI121-GUS载体和PxrbcS1、PxrbcS2质粒进行双酶切，并分别回收目的片段，利用T4 DNA ligase过夜连接转化大肠杆菌DH5α感受态，对获得的单克隆进行菌落PCR验证，筛选后的阳性克隆命名为pBI121-pPxrbcS1：：GUS、pBI121-pPxrbcS2：：GUS，送至哈尔滨生工生物技术有限公司测序。选取测序正确的质粒转化至农杆菌GV3101，验证元件保存菌种。
以野生型、转基因84K杨组培苗叶片DNA为模板，用附表1中的引物进行PCR扩增，反应体系如下：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共35个循环；72 ℃再延伸 4 min，4 ℃保存。
测定转基因植株的GUS基因表达量，使用CTAB法分别提取转基因84K杨根、茎、叶总RNA，反转录成cDNA，以其为模板，以PxUBQ7作为内参基因，利用附表1中的引物进行RT-qPCR，采用2-ΔΔCT法分析定量数据，并使用Excel 2010、SPSS 8.5和GraphPad Prism 8软件进行柱形图绘制和差异显著性分析。以上试验均设置3个生物学重复。
对小黑杨中3个Rubisco活化酶小亚基基因在叶片中的表达量进行分析，选取其中2个表达量较高的基因启动子进行克隆。结果表明，叶中PxrbcS1、PxrbcS2表达量较高（见图1）。
利用Plant CARE数据库分析PxrbcS1（2 240 bp）、PxrbcS2（2 174 bp）基因启动子序列顺式作用元件。结果表明，二者均具有多个光响应相关元件，其中包括G-box、Box 4、TCT-motif；参与植物激素反应的元件，如ABRE（参与脱落酸反应）、TCA-element（参与水杨酸反应）。除上述相关顺式作用元件外，PxrbcS2还含有参与光响应的MYB转录因子结合位点MRE和光响应元件ATC-motif（见图2， 表1）。由此推测，PxrbcS1、PxrbcS2启动子在表达过程中除了受到光的调控，还可能参与植物激素反应，在植物生长发育过程中可能具有多种生物学功能。
通过上述基因表达分析，利用特异性引物（附表1）通过PCR的方式从小黑杨叶片DNA中扩增出长度为2 240、2 174 bp的片段（见图3），目的片段胶回收后连接Zero TOPO-Blunt载体，转化大肠杆菌DH5α感受态。各随机选取4个单克隆菌落进行PCR检测，菌液送哈尔滨市生工生物工程公司测序，结果表明插入的片段未发生碱基突变，成功克隆得到小黑杨PxrbcS1、PxrbcS2启动子（序列见本刊网站电子附件）。
对转基因84K杨进行GUS染色并观察其表达特征。结果如图7~8所示，发现PxrbcS1、PxrbcS2启动子驱动的GUS基因在84K杨叶片中表达，表达产物β-葡萄糖苷酸酶具有显著活性。在茎和根中虽然有所表达，但活性较低。而在野生型84K杨中，并没有检测到GUS基因表达产物活性（见图7）。对转基因84K杨中GUS基因表达做定量分析（见图8），结果表明，转基因84K杨中GUS基因在植株根、茎、叶中均有表达，不同组织中的表达水平存在显著差异（P<0.05），叶中GUS表达量最高，与上述染色结果基本一致，说明PxrbcS1、PxrbcS2启动子可以在84K杨中驱动GUS基因表达，并且PxrbcS1、PxrbcS2启动子主要在杨树叶中发挥作用。
Rubisco是叶片可溶性蛋白的主要物质，占50%以上，主要存在于叶绿体基质中［21］。Rubisco可以固定空气中的CO2，其活化程度在光合效率最大时可达100%［22］。有研究［23］表明，在野生稻中，Rubisco的活力和含量与净光合速率呈正相关关系。Rubisco具有光诱导高效表达的特性，利用这一特性，可以更好地研究光合、光呼吸代谢基因功能。胥华伟等［24］从水稻基因组DNA中扩增rbcS基因启动子片段构建光诱导表达载体；刘晓庆等［25］克隆的含有大豆（Glycine max）rbcS基因的SRS4启动子具有一定的光诱导性。本研究从小黑杨基因组中鉴定出编码Rubisco小亚基基因PxrbcS1、PxrbcS2，并在小黑杨中进行了组织特异性表达分析，结果表明，PxrbcS1、PxrbcS2在小黑杨的叶和茎中均有表达，叶的表达量显著高于其他部位。启动子中的顺式作用元件对基因表达调控具有重要作用。克隆的小黑杨PxrbcS1、PxrbcS2启动子序列，通过在线软件分析，发现具有TATA-box和CAAT-box的核心元件，表明所克隆序列具有启动子的典型特征。
对克隆得到的启动子序列进一步分析发现，除了具有典型的核心元件之外，还具有许多与基因功能相关的元件，如G-box、Box 4、TCT-motif多个光响应相关元件。一些相似基因的启动子含有许多相同的顺式作用元件，在棉花（Gossypium hirsutum）GhRCA1启动子的研究中发现，其含有许多光应答元件（如ACE、BoxⅠ、BoxⅡ、G-box、I-box、GT1），可以调节GhRCA1基因表达，本研究也得到了类似的结果。此外还发现了与参与植物激素反应的元件，如ABRE（参与脱落酸反应）、TCA-element（参与水杨酸反应）。这些结果预示PxrbcS1、PxrbcS2除了参与植物光合作用外，可能还与植物体内激素代谢相关。通过分析PxrbcS1、PxrbcS2启动子顺式作用元件，发现该基因可能在植物生长发育中有着重要作用。
驱动GUS基因转化84K杨结果表明，PxrbcS1、PxrbcS2启动子可以驱动GUS基因在84K杨叶片和茎中表达，其中荧光定量PCR分析表明，叶中GUS基因表达量显著高于茎中。同时GUS染色也证明叶片染色程度明显强于茎，而根几乎没有被染色。上述研究表明，PxrbcS1、PxrbcS2启动子序列中有典型的启动子序列特征，并且可以驱动GUS基因表达，具有启动子活性和叶片组织特异性。
本文的其它图/表
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