钩藤水杨酸响应基因UrSTR4参与钩藤碱合成

doi:10.7525/j.issn.1673-5102.2025.04.003

摘要/Abstract

摘要：

钩藤（Uncaria rhynchophylla）是我国传统中药材，其活性成分钩藤碱（RIN）和异钩藤碱（IRN）具有显著药理活性。异胡豆苷合成酶（STR）是RIN和IRN合成的关键酶，但其基因家族在钩藤中的功能分化尚不明确。该研究基于遮阴、乙烯处理下钩藤转录组及全长转录组数据，系统鉴定了27个钩藤STR基因家族成员（UrSTR1~UrSTR27）。进化分析表明，钩藤UrSTR基因家族显著扩张，可能通过功能分化响应不同环境信号。通过外源水杨酸（SA）处理发现，0.6 mmol⋅L^-1 SA处理显著提升钩藤叶片RIN和IRN含量，并强烈诱导UrSTR4基因表达，该基因相对表达水平提高至对照的30.6倍。多序列比对显示，UrSTR4基因编码蛋白虽缺失典型催化位点Glu-309，但与喜树CaSTR3基因编码蛋白具有相似羟基氨基酸残基。为验证其功能，首次建立基于植物活体转化系统的钩藤高效瞬时转化体系，转化最佳条件：8 kPa气压，1 min农杆菌侵染。瞬时过表达UrSTR4基因使RIN和IRN含量分别提高至对照的1.96倍和1.82倍。该研究为钩藤药用成分的代谢调控提供了新靶点，建立的瞬时转化体系为UrSTR基因功能研究提供了技术支撑。

关键词: 钩藤, 异胡豆苷合成酶, 水杨酸, 瞬时转化, 单萜吲哚生物碱

Abstract:

Uncaria rhynchophylla is a traditional Chinese medicinal herb， whose active components rhynchophylline（RIN） and isorhynchophylline（IRN） exhibit remarkable pharmacological activities. Strictosidine synthase（STR） is the key enzyme for RIN and IRN biosynthesis， yet the functional divergence of STR gene family in U. rhynchophylla remains unclear. Utilizing transcriptome data of U. rhynchophylla seedlings under shading and ethylene treatments， 27 STR genes（UrSTR1-UrSTR27） were systematically identified in U. rhynchophylla. Evolutionary analysis revealed significant expansion of UrSTR gene family， suggesting functional diversification in response to environmental cues. Exogenous salicylic acid（SA） treatment（0.6 mmol⋅L^-1） markedly increased RIN and IRN contents， while upregulating UrSTR4 expression level by 30.6-fold. Multiple sequence alignment showed UrSTR4 lacked the conserved Glu-309 residue but shared hydroxyl-containing residues with Camptotheca STR3. An efficient transient transformation system（8 kPa pressure， 1-min Agrobacterium infection） was established by using plant living transformation instrument. The transient overexpression of UrSTR4 enhanced RIN and IRN contents by 1.96- and 1.82-fold， respectively. This study identified new targets for metabolic regulation of bioactive compounds in U. rhynchophylla and the established transient transformation system provided technical support for functional research on UrSTR genes.

Key words: Uncaria rhynchophylla, strictosidine synthase, salicylic acid, transient transformation, monoter-penoid indole alkaloids

中图分类号:

Q946

许国菊, 郭飘雪, 朱寻然, 杨兹梅, 成环宇, 强玮. 钩藤水杨酸响应基因UrSTR4参与钩藤碱合成[J]. 植物研究, 2025, 45(4): 491-503.

Guoju XU, Piaoxue GUO, Xunran ZHU, Zimei YANG, Huanyu CHENG, Wei QIANG. The Salicylic Acid Responsive UrSTR4 Gene is Involved in Rhynchophylline Biosynthesis in Uncaria rhynchophylla[J]. Bulletin of Botanical Research, 2025, 45(4): 491-503.

图/表 7

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参考文献 30

[1]	HEITZMAN M E， NETO C C， WINIARZ E，et al.Ethnobotany，phytochemistry and pharmacology of Uncaria （Rubiaceae）［J］.Phytochemistry，2005，66（1）：5-29.
[2]	ZHANG Q， ZHAO J J， XU J，et al.Medicinal uses，phytochemistry and pharmacology of the genus Uncaria ［J］.Journal of Ethnopharmacology，2015，173：48-80.
[3]	周浩，路星星，敖雯雯，等.钩藤STR基因及其启动子的克隆与分析［J］.药学学报，2022，57（5）：1526-1536.
	ZHOU H， LU X X， AO W W，et al.Cloning and analysis of STR gene and its promoter from Uncaria ［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2022，57（5）：1526-1536.
[4]	LI X， HAN H Q， WEI Y L，et al.Phytochrome interacting factor 3 mediates low light signaling to regulate isorhynchophylline biosynthesis in Uncaria rhynchophylla ［J］.Scientific Reports，2024，14（1）：25032.
[5]	YAMAZAKI Y， SUDO H， YAMAZAKI M，et al.Camptothecin biosynthetic genes in hairy roots of Ophiorrhiza pumila：cloning，characterization and differential expression in tissues and by stress compounds［J］.Plant and Cell Physiology，2003，44（4）：395-403.
[6]	KUTCHAN T M.Expression of enzymatically active cloned strictosidine synthase from the higher plant Rauvolfia serpentina in Escherichia coli ［J］.FEBS Letters，1989，257（1）：127-130.
[7]	FOUAD A， HEGAZY A E， AZAB E，et al.Boosting of antioxidants and alkaloids in Catharanthus roseus suspension cultures using silver nanoparticles with expression of CrMPK3 and STR genes［J］.Plants，2021，10（10）：2202.
[8]	JUMALI S S， SAID I M， ISMAIL I，et al.Genes induced by high concentration of salicylic acid in Mitragyna speciosa ［J］.Australian Journal of Crop Science，2011，5（3）：296-303.
[9]	LU Y， WANG H S， WANG W，et al.Molecular characterization and expression analysis of a new cDNA encoding strictosidine synthase from Ophiorrhiza japonica ［J］.Molecular Biology Reports，2009，36（7）：1845-1852.
[10]	SUN Y Z， LUO H M， LI Y，et al.Pyrosequencing of the Camptotheca acuminata transcriptome reveals putative genes involved in camptothecin biosynthesis and transport［J］.BMC Genomics，2011，12：533.
[11]	SHARMA A， VERMA P， MATHUR A，et al.Overexpression of tryptophan decarboxylase and strictosidine synthase enhanced terpenoid indole alkaloid pathway activity and antineoplastic vinblastine biosynthesis in Catharanthus roseus ［J］.Protoplasma，2018，255：1281-1294.
[12]	CUI L J， NI X L， JI Q，et al.Co-overexpression of geraniol-10-hydroxylase and strictosidine synthase improves anti-cancer drug camptothecin accumulation in Ophiorrhiza pumila ［J］.Scientific Reports，2015，5：8227.
[13]	SINGH S， KAMBLE S N， SATDIVE R K，et al.Heterologous overexpression of Nothapodytes foetida strictosidine synthase enhances levels of anti-cancer compound camptothecin in Ophiorrhiza rugosa ［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2020，141：67-76.
[14]	JIANG C X， YU J X， FEI X，et al.Gene coexpression networks allow the discovery of two strictosidine synthases underlying monoterpene indole alkaloid biosynthesis in Uncaria rhynchophylla ［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2023，226：1360-1373.
[15]	YANG M Q， YAO B W， LIN R M.Profiles of metabolic genes in Uncaria rhynchophylla and characterization of the critical enzyme involved in the biosynthesis of bioactive compounds-（iso） rhynchophylline［J］.Biomolecules，2022，12（12）：1790.
[16]	GUO E Y， YUAN M T， XU L J，et al.Identification of three key enzymes involved in the biosynthesis of tetracyclic oxindole alkaloids in Uncaria rhynchophylla ［J］.Bioorganic Chemistry，2023，136：106545.
[17]	穆德添，万凌云，韦树根，等.钩藤不同部位总RNA提取及UrSTR基因的克隆与表达分析［J］.农业生物技术学报，2022，30（9）：1737-1746.
	MU D T， WAN L Y， WEI S G，et al.Extraction of total RNA and cloning and expression analysis of UrSTR gene from Uncaria rhynchophylla ［J］.Journal of Agricultural Biotechnology，2022，30（9）：1737-1746.
[18]	路星星，强玮，付维，等.茉莉酸甲酯对钩藤生物碱合成的影响［J］.分子植物育种，2023，21（10）：3290-3296.
	LU X X， QIANG W， FU W，et al.Effects of methyl jasmonate on alkaloids biosynthesis in Uncaria rhyncho-phylla ［J］.Molecular Plant Breeding，2023，21（10）：3290-3296.
[19]	周浩，强玮，敖雯雯，等.外源脱落酸对钩藤中生物碱合成的影响［J］.分子植物育种，2024，22（15）：5091-5097.
	ZHOU H， QIANG W， AO W W，et al.Effect of exogenous abscisic acid on biosynthesis of alkaloids in Uncaria Rhynchophylla ［J］.Molecular Plant Breeding，2024，22（15）：5091-5097.
[20]	徐磊，胥晓，刘沁松.外源水杨酸对盐胁迫下珙桐幼苗抗氧化系统和基因表达的影响［J］.植物研究，2023，43（4）：572-581.
	XU L， XU X， LIU Q S.Effects of exogenous salicylic acid on antioxidant system and gene expression of Davidia involucrata seedlings under salt stress［J］.Bulletin of Botanical Research，2023，43（4）：572-581.
[21]	JEYASRI R， MUTHURAMALINGAM P， KARTHICK K，et al.Methyl jasmonate and salicylic acid as powerful elicitors for enhancing the production of secondary metabolites in medicinal plants：an updated review［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2023，153：447-458.
[22]	SÁNCHEZ-ROJO S， CERDA-GARCÍA-ROJAS C M， ESPARZA-GARCÍA F，et al.Long-term response on growth，antioxidant enzymes，and secondary metabolites in salicylic acid pre-treated Uncaria tomentosa microplants［J］.Biotechnology Letters，2015，37：2489-2496.
[23]	穆德会，刘艳红，陈漂漂，等.超表达HnCYP82M3和DsTRI基因对颠茄托品烷生物碱合成的影响［J］.药学学报，2024，59（3）：775-783.
	MU D H， LIU Y H， CHEN P P，et al.Enhancement of tropane alkaloids biosynthesis in Atropa belladonna hariy root by overexpression of HnCYP82M3 and DsTRI genes［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2024，59（3）：775-783.
[24]	王晓红.遮光影响钩藤碱和异钩藤碱生物合成的分子机制［D］.贵阳：贵州大学，2022.
	WANG X H.Molecular mechanisms of shade affecting the biosynthesis of rhynchophylline and isorhynchophylline in Uncaria rhynchophylla ［D］.Guiyang：Guizhou University，2022.
[25]	李雪.乙烯促进钩藤生物碱合成的机制研究［D］.贵阳：贵州大学，2022.
	LI X.Study on the mechanism of ethylene promoting the biosynthesis of alkaloids in Uncaria rhynchophylla［D］.Guiyang：Guizhou University，2022.
[26]	张智仙，王晓红，李雪，等.土壤自然干旱处理对钩藤生长与生理特征及主要药用成分积累的影响［J］.西北植物学报，2020，40（4）：658-666.
	ZHANG Z X， WANG X H， LI X，et al.Effect of soil natural drought on growth，physiological characteristics and accumulation of main medicinal components of Uncaria rhynchophylla ［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2020，40（4）：658-666.
[27]	YANG M Q， WANG Q， LIU Y N，et al.Divergent camptothecin biosynthetic pathway in Ophiorrhiza pumila ［J］.BMC Biology，2021，19：122.
[28]	MU D T， SHAO Y Y， HE J L，et al.Evaluation of reference genes for normalizing RT-qPCR and analysis of the expression patterns of WRKY1 transcription factor and rhynchophylline biosynthesis-related genes in Uncaria rhynchophylla ［J］.International Journal of Molecular Sciences，2023，24（22）：16330.
[29]	GUO Q Q， MA X J， WEI S G，et al. De novo transcriptome sequencing and digital gene expression analysis predict biosynthetic pathway of rhynchophylline and isorhynchophylline from Uncaria rhynchophylla，a non-model plant with potent anti-alzheimer’s properties［J］.BMC Genomics，2014，15（1）：676.
[30]	邓小红，姬拉拉，熊露露，等.不同海拔对钩藤生长及生物碱含量的影响［J］.植物生理学报，2020，56（10）：2095-2102.
	DENG X H， JI L L， XIONG L L，et al.Effects of different altitudes on growth and alkaloid content of Uncaria Rhynchophylla ［J］.Plant Physiology Journal，2020，56（10）：2095-2102.

引物名称 Primer name	引物序列（5′—3′） Primer sequence（5′—3′）	引物名称 Primer name	引物序列（5′—3′） Primer sequence（5′—3′）
F-STR4-OE	cacgggggactcttgggatccGCAATGACGCTGACCGGAT	R-STR4-OE	cgatcggggaaattcgagctcTAGGGAACTATTTTGTCACTCTAATTGG
Fq-GAPDH	AGCAAGGACTGGAGAGGTGGAAG	Rq-GAPDH	CCGTTGAGGGCTGGAAGAACTTTC
Fq-STR1	CTCCGCCATATAAAGGTG	Rq-STR1	GACAGAAGAAGCCAATCC
Fq-STR2	GGTAACAACTCCGAACAG	Rq-STR2	CACCATTAGGACCAACTAC
Fq-STR3	CCTCCTTACAGTGACTTC	Rq-STR3	GTCCATCAGAACCGTTAC
Fq-STR4	CAAGGACCTTATGCGAGCGTCTC	Rq-STR4	TTGGTCCAAGGTCGGGATTTGTTG
Fq-STR5	CATCCCTCTACCGTATAAAG	Rq-STR5	GAAGAAGCCTCTCCATTC
Fq-STR6	GATGGTCGGATTCTCAAG	Rq-STR6	GATGAACACACTCCTTCC
Fq-STR7	CTTCTTCTCCTCATCTTCG	Rq-STR7	GACAACTCTGCCATCTTC
Fq-STR8	GGTTCAAGACATCCTGAG	Rq-STR8	GCCATCTCTGCTAACTTC
Fq-STR9	CTCTCTCATCCTCCTCAA	Rq-STR9	GTAGACCACAACTGCTAG

基因名称 Gene name	氨基酸残基 Amino acid residues/aa	相对分子质量 Molecular weight/Da	不稳定系数 Instability index	等电点 Isoelectric point/pI	亲水性 Hydrophilicity	脂肪指数 Aliphatic index
UrSTR1	359	39 757.77	26.91	5.44	-0.196	82.79
UrSTR2	340	37 332.35	32.45	7.71	-0.244	82.26
UrSTR3	419	42 301.06	33.62	6.92	-0.254	86.18
UrSTR4	391	43 858.54	38.06	7.59	-0.179	87.77
UrSTR5	345	37 974.68	25.40	5.49	-0.186	85.30
UrSTR6	301	33 662.11	34.82	7.82	0.034	101.99
UrSTR7	353	38 959.17	31.16	5.22	-0.119	86.69
UrSTR8	345	37 957.65	26.18	5.28	-0.184	87.28
UrSTR9	397	44 083.25	28.70	5.77	-0.151	92.54
UrSTR10	341	36 791.16	28.91	5.71	0.085	99.18
UrSTR11	296	32 642.00	34.72	6.52	-0.165	84.59
UrSTR12	191	20 798.44	20.61	4.53	0.017	95.39
UrSTR13	64	7 234.31	38.38	8.55	-0.331	63.75
UrSTR14	341	36 791.16	28.91	5.71	0.085	99.18
UrSTR15	175	20 227.28	27.83	9.34	-0.341	86.86
UrSTR16	175	20 237.32	27.40	9.38	-0.346	86.86
UrSTR17	187	20 584.27	17.69	5.85	-0.234	92.73
UrSTR18	175	20 295.36	27.40	9.25	-0.376	86.29
UrSTR19	140	15 445.99	27.56	10.01	-0.013	93.36
UrSTR20	52	5 639.56	15.13	9.82	-0.073	97.31
UrSTR21	81	8 790.11	11.97	10.11	-0.200	90.12
UrSTR22	80	8 852.30	26.24	9.58	-0.129	97.37
UrSTR23	177	19 459.11	22.71	6.29	-0.160	94.63
UrSTR24	153	16 949.43	19.75	9.68	-0.186	88.43
UrSTR25	66	7 253.40	22.19	9.99	-0.255	88.48
UrSTR26	256	27 801.75	30.32	5.16	-0.054	92.85
UrSTR27	381	42 185.94	26.32	5.32	0.257	107.43